實時熒光定量擴增系統(tǒng)(qPCR)作為分子生物學領(lǐng)域的一項革命性技術(shù)，自1996年由美國Applied Biosystems公司推出以來，已廣泛應(yīng)用于基因表達分析、病原體檢測、遺傳變異研究等多個領(lǐng)域。該技術(shù)通過實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，實現(xiàn)了對目標DNA或RNA序列的精確量化，為科研人員提供了前-所未有的精準度與效率。

　　技術(shù)原理

　　qPCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。熒光基團可以是SYBR Green等非特異性染料，也可以是TaqMan探針等特異性標記。隨著PCR循環(huán)的進行，熒光信號會隨著擴增產(chǎn)物的增加而增強，從而允許實時監(jiān)測并定量初始模板的數(shù)量。

　　熒光擴增曲線一般由基線期、指數(shù)擴增期和平臺期組成。在基線期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化;在指數(shù)擴增期，熒光信號超過背景信號并到達閾值，此時循環(huán)數(shù)稱為Ct值(Cycle Threshold)，Ct值與模板起始濃度的對數(shù)值成反比線性關(guān)系，因此可用于定量模板起始濃度;在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，無法用于定量分析。

　　主要類型與定量方法

　　qPCR所使用的熒光化學材料可分為兩大類：熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR Green I為主要代表，是非特異性熒光化學材料，能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合并發(fā)出熒光，信號強度與PCR擴增的DNA量成正比。熒光探針包括TaqMan、分子信標等，屬于特異性熒光材料。TaqMan探針技術(shù)通過設(shè)計特異性探針，在PCR擴增過程中被切割釋放熒光信號，實現(xiàn)高特異性和準確性的定量分析。

　　定量方法包括絕對定量和相對定量。絕對定量是通過繪制標準曲線，利用已知起始拷貝數(shù)的標準品來計算未知樣品的起始拷貝數(shù);相對定量則是通過比較不同樣本中同一目的基因的相對表達量來分析基因表達差異。

　　應(yīng)用領(lǐng)域

　　qPCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分子生物學、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。在分子生物學研究中，qPCR技術(shù)可用于基因表達調(diào)控、基因組學和表觀遺傳學研究;在醫(yī)學領(lǐng)域，qPCR技術(shù)可用于腫瘤標志物檢測、傳染病監(jiān)控及個性化醫(yī)療;在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，qPCR技術(shù)可用于轉(zhuǎn)基因作物的定性檢測、品系鑒定及轉(zhuǎn)基因成分含量的檢測。

　　結(jié)論

　　實時熒光定量擴增系統(tǒng)(qPCR)以其高靈敏度、特異性和準確性，在核酸定量分析中發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷進步，qPCR系統(tǒng)的功能和性能也在不斷提升，為科研人員提供了更加高效、精準的實驗工具。未來，qPCR技術(shù)有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，推動科學研究的深入發(fā)展。